На правах рукописи
Золотарева Наталья Владимировна
Регуляция каталитической активности
алкогольдегидрогеназы фармакологическими препаратами
Пирацетам, Зорекс и Унитиол
03.01.04 – биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Тверь – 2011
Работа выполнена на кафедре физико-химической экспертизы биоорганических соединений Тверского государственного университета
Научный руководитель
доктор химических наук, профессор
Лапина Галина Петровна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Рабинович Галина Юрьевна
кандидат биологических наук, доцент Карцова Софья Владимировна
Ведущая организация
Самарский государственный медицинский университет
Защита диссертации состоится « 12 » мая 2011 года в 14 00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.263.08 при Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70/1Б, корп. 5, ауд. 318.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета по адресу: 170100, г. Тверь, ул. Володарского, 44 а.
Автореферат разослан «___» апреля 2011 года
Ученый секретарь
диссертационного совета
Н. В. Костюк
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Одна из наиболее актуальных в физико-химическом аспекте проблем биохимии алкоголизма – регуляция активности алкогольдегидрогеназы (АДГ). В ряде исследований (Островский Ю. М., Сатановская В. И., Садовник М. Н., 1969; White, A. M., 1998; Нужный В. П., 2002 и др.) установлено, что в качестве субстрата фермента наиболее часто используется этанол. Достаточно полно изучен физиологический аспект действия этанола на организм человека (Бурков Ю. В., Иванова Н. Н., 2008), а также исследован ферментативный механизм утилизации этанола в организме человека (Груздева К. Н., 2001 и др.) при участии фермента алкогольдегидрогеназы. Однако вопросы регуляции ферментативной активности алкогольдегидрогеназы изучены недостаточно.
Алкогольдегидрогеназа – фермент класса оксидоредуктаз (1.1.1.1), катализирующий процессы окисления никотинамидадениндинуклеотидом (НАД) первичных алифатических спиртов в соответствующие альдегиды (Диксон М., Уэбб Э., 2005). Алкогольдегидрогеназы найдены в тканях животных (печени лошади) (Xie P., 2005), растениях (томатах и картофеле), грибах, дрожжах, бактериях (Авилова Т. В., 2001) и др. Наиболее изученными ферментами являются алкогольдегидрогеназы, выделенные из дрожжей, а также печени лошади (Сапожников Г. П., Лозитнова А. Б., 2004; Лапина Г. П., Золотарева Н. В., 2006 – 2008).
Алкогольдегидрогеназы являются недостаточно исследованными биокатализаторами c точки зрения использования различных фармпрепаратов, применяемых для лечения больных хроническим алкоголизмом (Буров Ю. В., Ведерникова Н. Н., 2002). До настоящего времени актуальным является поиск специфических эффекторов фермента алкогольдегидрогеназы, окисляющих этанол, с целью регулирования концентрации этанола и ацетальдегида в организме, что важно в изучении молекулярных основ биохимии алкоголизма (Буров Ю. В., Ведерникова Н. Н., 1984; Марри Р., Греннер Д., 1993; Goldberg L., Rudberg U., 2004).
Вопросы изучения и установления молекулярных механизмов такого рода эффекторов (активаторов или ингибиторов фермента) относятся к перспективным направлениям современной энзимологии и обсуждались на Symposium of A. I. Oparin: «Biochemistry of the twenty-first century: problems and frontiers», 1994; а также в работах (Бонитенко Е. Ю., 2003; Zidoni Е., Кrеter M., 2004 и др.). Поиск решения поставленной задачи и определяет актуальность данной работы.
В практической медицине довольно широко используются фармпрепараты Пирацетам и Зорекс (Wyllie M. G., Paciorec P. M., 2001; Waterfall J. F., 2003). Физиологические основы действия данных регуляторов известны: Пирацетам, являясь ноотропным фармпрепаратом, изменяет метаболические и биоэнергетические процессы в нервной клетке, улучшает функции головного мозга, усиливая кровоток (Руденко Г. М., 1996; Benzi G., Pastoris O., 1997); Унитиол, в свою очередь, в составе Зорекса способствует восстановлению обмена веществ в нервных клетках и выведению продуктов распада этанола из органов и тканей (Ostrovskaja R. U., Hoffmann W., Molodawkin G. M., 1993; Roglev M., 2001).
Эффективное использование этих фармпрепаратов базируется на информации о молекулярно-кинетическом характере их действия на фермент АДГ, который в полной мере не изучен.
Цель работы: исследование молекулярно-кинетического механизма действия фармакологических препаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола (составной части Зорекса) на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы в условиях in vitro.
Задачи исследования:
1. Выделить и очистить алкогольдегидрогеназу из пекарских дрожжей по методу Г. А. Кочетова. Определить субстратную специфичность фермента в группе этанол-бутанол-изопропанол и рассчитать его основные ферментативные параметры и выявить оптимальную концентрацию специфичного субстрата. Сравнить ферментативные показателей алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей и алкогольдегидрогеназы печени лошади.
2. Разработать многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади в присутствии регуляторов и оптимизировать его:
- рассчитать значения важнейших ферментативных параметров каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади для системы контроля;
- выявить влияние Пирацетама и никотинамидадениндинуклеотида на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы. Найти их оптимальные концентрации;
- определить действие Зорекса и Унитиола на активность биокатализатора.
3. Установить тип регулирования (активации или ингибирования) алкогольдегидрогеназы в присутствии Пирацетама, Зорекса и Унитиола.
4. Для изученных ферментативных систем построить геометрический «портрет» в трехмерной Kм' V' – системе координат и на этой основе рассчитать дополнительный ферментативный параметр (длину 
Рис.1. Схема выделения и очистки АДГ из пекарских дрожжей по методу Г. А. Кочетова с собственными модификациями
– Метод калибровочного графика, построенного по белку-стандарту – коммерческому препарату сывороточный альбумин человека (рис.2), применяли для оценки и расчета концентрации ферментативно-активного белка.
– Метод определения ферментативной кинетической активности АДГ. При окислении этилового спирта образуется восстановленный НАД, количество которого определяли фотометрически.
АДГ
С2Н5ОН+НАД + СН3СНО + НАД·Н + Н+
Измеряли увеличение значения оптической плотности (D) при длине волны 340 нм во времени (t). Контрольная кювета не содержала субстрата. Активность рассчитывали исходя из данных, полученных в течение 15—45 с хода ферментативной реакции.
– Метод Лайнуивера–Берка для обработки данных ферментативной кинетики и расчета важнейших ферментативных параметров: Km – константы Михаэлиса, Vmax – максимальной скорости реакции и Kкат – константы каталитической. В ходе ферментативной реакции рассчитывали начальные скорости реакций по зависимостям оптической плотности (D) во времени (t), строили прямые в координатах Лайнуивера–Берка (1/V и 1/[S]) и вели расчет важнейших ферментативных параметров – Кm, Vmax и Kкат.
– Метод векторных диаграммных построений. В трехмерной Kм'V'-системе прямоугольных координат каждая ингибируемая или активируемая ферментативная реакция получает свое векторное представление – конкретный трехмерный вектор L этой реакции. При этом длина данного вектора характеризует интенсивность протекания ферментативной реакции: положение L вектора в системе координат – тип изучаемой реакции, направление смещения – тенденцию к смене типа реакции, а траектория, описываемая подвижным концом вектора, – геометрический «портрет» изучаемой реакции.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Изученные ферментативные системы:
Ферментативная система-1 (система контроля): АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), НАД различных концентраций (5,0; 4,5; 4,0; 3,5; 2,5; 1,5)(10-2М).
Ферментативная система-2 состоит из АДГ печени лошади (2,41·10-4М), этанола С2Н5ОН (1,510-2М), НАД (1,510-2М) при различных концентрациях Пирацетама (0,5–4,5)(10-2М).
Ферментативная система-3, включающая фермент АДГ печени лошади (2,41·10-4М), этанол С2Н5ОН (1,510-2М), Пирацетам (1,510-2) при варьировании концентрации НАД (0,5–4,5)(10-2М).
Ферментативная система-4 состоит из АДГ печени лошади (2,41·10-4М), этанола С2Н5ОН (1,510-2М), Зорекса (5·10-2М) при варьировании концентрации НАД (1,5–5,0)(10-2М).
Ферментативная система-5: фермент АДГ печени лошади (2,41·10-4М), этанол С2Н5ОН (1,510-2М), Унитиол (5·10-2М) (как составная часть Зорекса) при варьировании концентраций НАД (1,5–5,0)(10-2М).
Первый этап работы, изложенный в пункте 4.1 диссертации, посвящен выделению и очистке АДГ из пекарских дрожжей (рис. 1) по методу Г. А. Кочетова с собственными изменениями. Изучена субстратная специфичность АДГ в группе различных субстратов (этиловый, бутиловый и изопропиловый спирты). Определены важнейшие ферментативные параметры – Кm, Vmax и Kкат, найдена оптимальная концентрация этанола.
По калибровочной зависимости (рис. 2) рассчитали содержание ферментативно активного белка в полученных экстрактах. Для значения величины оптической плотности (D), равной 0,50 опт. ед., по калибровочной кривой нашли значение концентрации фермента, составившее 8,42·10-5 г белка /г сырой массы дрожжей или 2,41·10-4М.
Рис. 2. Калибровочная зависимость оптической плотности (D) от концентрации белка (С)
сывороточного альбумина человека («Reanal», Венгрия)
Для изучения субстратной специфичности использовали водные растворы различных субстратов: этанола, изопропанола и бутанола-1, концентрации которых меняли в интервале (1,5–6,0)·10-2М. Далее определяли кинетику течения биокаталитической реакции по изменению величины оптической плотности (D) во времени (t). В качестве примера на рис. 3 представлены зависимости D~t для водного раствора субстрата этанола концентраций и (·10-2М) 6,0 и 1,5.
Рис. 3. 3асимости оптической плотности (D) во времени (t) окисления субстрата-этанола водным раствором АДГ (2,41·10-4М) печени лошади для концентраций (·10-2М) субстрата: a – 6,0 и b –1,5
На основе кинетических зависимостей (рис. 3) рассчитывали начальные скорости АДГ-зависимых ферментативных реакций (V0), которые спрямляли в координатах двойных обратных величин (координатах Лайнуивера–Берка) (рис. 4).
Рис. 4. Зависимость обратных величин начальных скоростей от обратных величин концентраций субстратов этанола – (·) и НАД – (
) для водного раствора АДГ дрожжевой (2,41·10-4М)
На основе рис. 4 провели расчет значений Km, Ккат и Vmax для водного раствора фермента (2,41·10-4М), которые составили, соответственно, (2,85 ± 0,19)·10-5М; (9,23 ± 0,18)·10-2с-1 и (3,86 ± 0,18)·10-5опт. ед./с. Полученные характеристики корректно согласуются с данными литературы (Xie P., Parsons S. H., Speckhard D. C., 1997), что указывает на достоверность полученных данных.
По вышеприведенной схеме определены ферментативные параметры для двух других субстратов: бутанола-1 и изопропанола (табл.1). В ряду субстратов-спиртов (этанол, бутанол-1 и изопропанол) численные значения Km возрастают в 3,2 раза и уменьшаются в 1,6 раза значения Vmax. Это означает, что в изученной группе субстратов АДГ: этанол – бутанол-1 – изопропанол, – сродство их к ферменту постепенно снижается. Для этанола найдена максимальная активность АДГ дрожжевой (Vmаx), минимальная – для изопропанола.
Таблица 1
Рассчитанные параметры ферментативной активности АДГ дрожжевой для водных растворов различных спиртов – субстратов
Субстрат
Кm,·10-5 М
Vmax,·10-5 опт. ед./с
Ккат,·10-2 с-1
Этиловый спирт
2,85±0,19
3,86±0,18
9,23±0,18
Бутиловый спирт
6,67±0,21
2,47±0,21
6,19±0,21
Изопропиловый спирт
9,09±0,20
1,49±0,20
3,47±0,20
Активность (Ккат) по бутанолу-1 и изопропанолу уменьшается в 1,5 и 2,5 раза по сравнению со скоростью окисления этанола. Таким образом, обнаружено, что с различными субстратами биокатализ идет по-разному, что свидетельствует о наличии субстратной специфичности АДГ дрожжевой. Выявлен наиболее оптимальный субстрат – этанол, для которого значение Ккат максимально и составляет (9,23±0,19)·10-2с-1.
Следует отметить, что изучение ферментативного процесса, катализируемого АДГ, при варьировании концентрации второго компонента субстрата – НАД – позволило получить значения Km и Vmax близкие к тем, что были рассчитаны для ферментативной системы при варьировании второго компонента субстрата-этанола.
Полученные данные согласуются с (Hurley T. D., Bosron W. F., Stone C. L., 1994), где определена субстратная специфичность для АДГ, выделенной из других природных источников (растений и грибов), что подтверждает универсальность полученных результатов.
На первом этапе исследовательской работы разработаны собственные эффективные модификации метода выделения и очистки фермента. Освоен и применен кинетический метод определения ферментативных параметров алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей, а также изучена и установлена субстратная специфичность АДГ дрожжевой, т. е. оптимизированы условия для выполнения последующих этапов дальнейшей работы.
На втором этапе работы определены кинетические параметры каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади в системе контроля (сравнения), включающей АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), но при варьировании концентрации НАД (0,5–5,5)10-2М (ферментативная система-1). В ходе определения активности АДГ печени лошади построены кинетические зависимости изменения оптической плотности (D) во времени (t) в системе контроля для следующих концентраций НАД (0,5–5,5)10-2М. Кинетические зависимости имели стандартный вид кривых с насыщением. По освоенной схеме построены спрямленные кинетические зависимости в координатах Лайнуивера–Берка и рассчитаны параметры Кm, Ккат и Vmax для ферментативной системы-1, включающей АДГ печени лошади (табл. 2).
Таблица 2
Показатели ферментативной активности АДГ пекарских дрожжей и АДГ печени лошади при использовании водного раствора
субстрата – этилового спирта
Km,·10-5 М
Vmax,·10-5 опт. ед./с
Ккат, ·10-1с-1
АДГ пекарских дрожжей
2,85±0,19
3,86±0,18
9,23±0,18
АДГ печени лошади
2,51±0,17
3,51±0,17
8,94±0,17
По особенностям построения первичной, вторичной, третичной и четвертичной структур (Forsht A.., 1995) а также по механизму каталитического действия (Курганов Б. И., 2008) эти два фермента (АДГ дрожжевая и АДГ печени лошади) практически идентичны. Близкие значения ферментативных параметров АДГ дрожжевой и АДГ печени лошади позволили провести исследование по влиянию эффекторов (Пирацетама, Зорекса и Унитиола) на АДГ печени лошади (коммерческий препарат) в модельных системах.
На третьем этапе исследовано влияние фармакологического препарата Пирацетама на каталитические параметры АДГ печени лошади в ферментативной системе-2, содержащей АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), Пирацетам (1,510-2М) при варьировании концентрации НАД (0,5–4,5)10-2М и в ферментативной системе-3, включающей АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), НАД (1,510-2М) при различных концентрациях Пирацетама (0,5–4,5)10-2М. Для сравнения кинетических параметров в ферментативной системе-2 и ферментативной системе-3 применили три способа изучения ферментативных характеристик биокатализатора:
1. Оценочный по выявлению возможного влияния и Пирацетама, и НАД (при варьировании их концентраций) на каталитическую активность АДГ печени лошади посредством анализа кинетических кривых D~t. На кривых D~t определяли Vmаx и строили зависимости в координатах Vmаx – концентрация Пирацетама.
2. В рамках классической энзимологии строили кинетические зависимости D~t. К начальным участкам полученных кривых проводили касательные и определяли начальные скорости (V0). Экспериментальные данные обрабатывали, используя способ, предложенный Лайнуивером–Берком, и рассчитывали важнейшие ферментативные параметры Vmаx, Km и Kкат.
3. Построение геометрического «портрета» изучаемой реакции, катализируемой АДГ, в трехмерной Kм'V' – системе прямоугольных координат для расчета дополнительных ферментативных параметров (длин 
-, 
Ферментативные параметры
1-й способ
2-й способ
Система контроля
Кm, ·10-5М
-
8,47±0,37
2,51±0,17
Vmах, ·10-5
опт. ед./с
19,80±0,32
20,01±0,37
3,51±0,17
В результате введения в ферментативную систему Пирацетама (1,5·10-2М) повышается активность АДГ, что, возможно, может привести к усиленному окислению этанола в организме человека и, следовательно, к уменьшению его интоксикации (Consalvi V., 1998; Gough W. H., 2001).
В связи с тем, что важная роль в биокаталитической реакции принадлежит НАД, необходимо определить оптимальную концентрацию этого компонента в модельной ферментативной системе. Для этого изучали возможное влияние различных концентраций НАД на активность АДГ печени лошади посредством анализа кинетических кривых D~t. Это позволило построить зависимость начальной скорости реакции (Vо) от концентрации НАД (рис.6).
Рис 6. Зависимость максимальной скорости реакции от концентрации НАД для ферментативной системы-3
Значение концентрации НАД, составляющей 1,5·10-2М, является оптимальным для ферментативной системы-2, поскольку зависимость имеет вид кривой с насыщением (рис. 6).
Рассчитали следующие значения Кm, Ккат и Vmах для ферментативной системы-3 (рН 6,0), содержащей АДГ печени лошади (2,41·10-4М), Пирацетам (1,5·10-2М), С2Н5ОН (1,5·10-2М) и НАД (0,5–4,5)10-2М и сравнили с полученными кинетическими параметрами для ферментативной системы-2 (табл. 4).
Таблица 4
Кинетические параметры ферментативной реакции (Km и Vmax)
для водных растворов АДГ, рассчитанные по двум способам (1-й и 2-й) для ферментативной системы-2 и ферментативной системы-3
Кm,·10-5 моль/л
Vmax, 10-5 опт. ед./с
1-й способ
2-й способ
1-й способ
2-й способ
Ферментативная система-2
-
8,47±0,39
19,80±0,32
20,01±0,39
Ферментативная система-3
5,89±0,39
5,03±0,39
11,78±0,38
12,01±0,38
Система контроля
2,51±0,17
3,51±0,17
Обнаружена корреляция ферментативных параметров Кm и Vmах, рассчитанных 2-мя способами. Значения Km, полученные при использовании 2-го способа, в ферментативной системе-3 ниже в 1,5 раза в сравнении с ферментативной системой-2. В случае параметра Vmax наблюдали так же, как и в предыдущем случае, снижение этой характеристики в 1,7 раза при применении и 1-го, и 2-го способов. Кроме того, выявлено, что кинетические параметры активности АДГ печени лошади (Кm и Vmax) зависят от концентрации и Пирацетама, и НАД.
Обращает на себя внимание, что для концентраций и Пирацетама, и НАД, равных 1,5·10-2М, скорости ферментативного процесса максимальны и в случае ферментативной системы-2, и для ферментативной системы-3.
Таким образом, изучив ферментативную систему-2 и ферментативную систему-3, нашли оптимальные условия окисления этилового спирта (1,5·10-2М) при концентрациях компонентов модельной системы: АДГ печени лошади – 2,41·10-4М, Пирацетама – 1,5·10-2М и НАД – 1,5·10-2М в условиях рН 6,0.
Используя найденные изменения параметров Km и V в ферментативной системе-3 при сравнении с системой контроля, выявили тип активации.
Прямая 2 располагается ниже прямой 1 системы контроля (ферментативная система-1), что, согласно классификации В. И. Крупянко, соответствует двухпараметрически рассогласованной активации, т. е. IIa-типу активации АДГ.
Рис. 7. Зависимости обратных величин начальных скоростей от обратных величин концентраций субстрата НАД для водного раствора АДГ (2,41·10-4 М) в ферментативной системе-1 (прямая 1) и ферментативной системе-3 (прямая 2)
На четвертом этапе определяли влияние фармакологических добавок Зорекса и Унитиола на каталитическую активность АДГ печени лошади при изучении влияния различных концентраций НАД, осуществляющих биокатализ в ферментативной системе-4 и ферментативной системе-5. Ферментативная система-4 включала следующие компоненты: АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), Унитиол (5,0·10-4М). Кинетические зависимости D~t строили при варьировании концентрации НАД (1,5–5,0) 10-2М. Ферментативная система-5 состояла из АДГ печени лошади (2,41·10-4М), С2Н5ОН (1,510-2М), Зорекса (5,0·10-4М) и включала различные концентрации НАД (1,5–5,0) 10-2М.
При построении экспериментальных кинетических зависимостей в координатах Лайнуивера–Берка определили важнейшие кинетические параметры для изучаемых систем (табл. 5).
Таблица 5
Рассчитанные данные по ферментативной кинетике для ферментативной системы-1, ферментативной системы-4 и ферментативной системы-5
Km,
·10-5 М
Vmаx,·10-5 опт. ед./с
Kкат,
·10-2с-1
Тип активации
Система контроля (ферментативная система-1)
2,51±0,17
3,51±0,17
8,94±0,17
-
Зорекс
(ферментативная система-4)
2,03±0,17
6,62±0,17
1,63±0,17
Ia
Унитиол
(ферментативная система-5)
2,42±0,16
6,34±0,16
1,48 ±0,16
Ia
Видно, что введение в ферментативную систему фармпрепаратов Зорекса и Унитиола (табл. 5) приводит к снижению значения Km на 16 – 20 %, и следовательно, улучшается взаимодействие фермента (АДГ печени лошади) и субстрата (C2H5OH) в сорбционном участке активного центра фермента. Этому могут способствовать особенности строения активного центра АДГ печени лошади (Крупянко В. И., 1994).
Наблюдали значительное уменьшение значений константы Kкат (табл. 5) и в ферментативной системе-4, и в ферментативной системе-5. Это свидетельствует о том, что в фармпрепарате Зорекс составляющая часть – Унитиол (ферментативная система-5) – действительно играет доминирующую роль в регуляции каталитического поведения АДГ, усиливая практически в 2 раза каталитическое действие фермента. На основе полученных закономерностей в изменении важнейших ферментативных параметров АДГ по классификации В. И. Крупянко установили тип активации – двухпараметрически согласованная активация – Iа-тип активации АДГ.
В условиях оптимального соотношения концентраций всех компонентов реакционной среды, а именно АДГ, этанола, НАД, Пирацетама, Зорекса и Унитиола, рассчитаны ферментативные параметры (табл. 6).
Таблица 6
Значения каталитических характеристик АДГ при введении фармпрепаратов Пирацетама, Зорекса и Унитиола
Фермента-тивные
системы
Эффекторы
Молеку-лярная масса
Km,
·10-5М
Vmax, ·10-4 опт. ед./с
Тип
акти-
вации
1
Контроль
-
2,51±0,17
3,51±0,17
-
3
Пирацетам
142,16
5,03±0,39
20,01±0,39
IIa
4
Зорекс
630,09
2,03±0,17
6,62±0,17
Ia
5
Унитиол
124,23
2,12±0,16
6,34±0,16
Ia
Пирацетам в большей степени влияет на образование фермент-субстратного комплекса. Суммарный наблюдаемый эффект – ослабление взаимодействия фермента и субстрата при введении Пирацетама. Именно в этих условиях активность алкогольдегидрогеназы максимальна. Следовательно, при добавлении Пирацетама этанол с участием АДГ утилизируется наиболее эффективно.
Рассчитанные ферментативные параметры и соответственно типы активации фермента для фармпрепаратов Пирацетам, Зорекс и Унитиол в ферментативных системах имеют разнонаправленный характер изменений: в случае Пирацетама – тип активации IIa, а в случае Зорекса и Унитиола – тип активации Ia. Это не позволило провести сопоставление найденных значений ферментативных параметров АДГ, так как типы активации различны. Поэтому наряду с первым и вторым способами определения ферментативных параметров был применен ещё один способ анализа значений ферментативных параметров – это метод векторного построения полученных экспериментальных данных в Kм' V'– системе координат.
На основе данных табл. 6 построили кривую течения – геометрический «портрет» ферментативной реакции, катализируемой АДГ печени лошади (рис. 8).
Рис.8. Пространственная кривая АДГ-реакции в трехмерной Kм' V' – системе координат, активируемой фармпрепаратами Зорекс (3), Унитиол (1) и Пирацетам (2)
На основе рис.8. рассчитали дополнительный ферментативный параметр – интенсивность активации для трех обсуждаемых ферментативных систем и сравнили длины 
-, 
-, 
-векторов
Ферментативные
системы
Длины 
- векторов, у. е.
Пирацетам
3
2,50
Зорекс
4
0,48
Унитиол
5
0,39
Самым действенным для АДГ среди изученных фармпрепаратов является Пирацетам (2,50 у. е.). Эффективность фармпрепаратов Зорекс и Унитиол в сравнении с Пирацетамом в 5,2 раз ниже. Кроме того, данные табл. 7 указывают на преобладающий вклад компонента Зорекса в сравнении с Унитиолом. Обращает на себя внимание то, что при введении в ферментативную систему изученных фармпрепаратов (Пирацетама, Зорекса и Унитиола) меняются не только тип активации, но и механизм изучаемой каталитической реакции, а также её интенсивность.
Таким образом, впервые разработанный и апробированный многоэтапный научно-методический подход позволил детально изучить ферментативное поведение АДГ при добавлении Пирацетама, Зорекса и Унитиола и может служить основой для изучения других фармпрепаратов.
ВЫВОДЫ
1. Выделена и очищена алкогольдегидрогеназа из пекарских дрожжей. Рассчитано содержание фермента, изучена субстратная специфичность и исследованы важнейшие ферментативные параметры биокатализатора. Выявлена максимальная субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы дрожжевой к этанолу.
2. Разработан многоэтапный научно-методический подход по изучению каталитической активности алкогольдегидрогеназы в модельной ферментативной системе в присутствии регуляторов каталитической активности:
· для системы контроля определены значения важнейших ферментативных параметров каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади: Кm = (2,51 ± 0,17)·10-5 моль/л; Vmax = (3,51 ± 0,17)·10-5 опт. ед./с; Ккат = (8,94 ± 0,17)·10-2 с-1. Найдено удовлетворительное соответствие ферментативных показателей алкогольдегидрогеназы печени лошади и алкогольдегидрогеназы пекарских дрожжей;
· введение Пирацетама ухудшает связывание фермента с субстратом (значения Km больше на 71 %, чем в системе контроля), но улучшает течение каталитической реакции (в 5,7 раз возрастает значение Vmax) при использовании 1-го и 2-го способов. Наибольшее влияние на алкогольдегидрогеназу найдено для концентрации Пирацетама, составляющей 1,5·10-2М;
· наиболее эффективное течение ферментативного процесса наблюдается для концентрации никотинамидадениндинуклеотида равной 1,5·10-2М;
· каталитическая активность алкогольдегидрогеназы возрастает в 2,6 раза при добавлении Зорекса в модельную систему, а в случае с Унитиолом найдено двукратное возрастание активности биокатализатора. Введение в ферментативную систему Зорекса и Унитиола на 16 – 20 % улучшает взаимодействие фермента (алкогольдегидрогеназы печени лошади) и субстрата (C2H5OH) в сравнении с системой контроля.
3. При введении в модельную ферментативную систему Пирацетама установлен тип активации – IIа-тип (двухпараметрически рассогласованная активация). При использовании Зорекса и Унитиола алкогольдегидрогеназа активируется по Iа-типу (двухпараметрически согласованная активация).
4. Построена и проанализирована пространственная кривая течения кинетической реакции для алкогольдегидрогеназы, её геометрический «портрет», при добавлении в ферментативную систему Пирацетама, Зорекса и Унитиола. Установлено, что введение изученных фармпрепаратов в модельную систему с алкогольдегидрогеназой меняет не только интенсивность, но и тип и механизм изученной ферментативной реакции. Рассчитан дополнительный ферментативный параметр – длина вектора, показавший, что наиболее эффективным для активации алкогольдегидрогеназы является фармпрепарат Пирацетам.
Список опубликованных работ по теме диссертации
1. Сметанникова Н. В. Ферментативные характеристики алкогольдегидрогеназы // Сб. тез. V научной конференции аспирантов и студентов химического факультета, посвященной 35-летию Тверского государственного университета. – Тверь: Твер. гос. ун-т, 2006. – С. 30.
2. Лапина Г. П., Сметанникова Н. В. Регуляция активности алкогольдегидрогеназы печени лошади Пирацетамом // Тез. докл. I Междунар. конф. «Состояние воды в биологических и модельных системах» Тверская гос. мед. академия. – Тверь, 2007. – С. 173.
3. Лапина Г. П. Золотарева Н. В. Регуляция активности алкогольдегидрогеназы печени лошади Пирацетамом // Тез. докл. VII науч. конф. аспирантов и студентов химического факультета Тверского государственного университета. – Тверь: Твер. гос. ун-т, 2008. – С. 25.
4. Золотарева Н. В. Воздействие Пирацетама на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы печени лошади // Тез. докл. XVI Региональные Каргинские чтения «Физика, химия и новые технологии». – Тверь: Твер. гос. ун-т, 2009. – С.39.
5. Золотарева Н. В. Геометрический «портрет» ферментативной реакции, катализируемой алкогольдегидрогеназой, в присутствии различных эффекторов // Тез. докл. XVII Региональные Каргинские чтения «Физика, химия и новые технологии». – Тверь: Твер. гос. ун-т, 2010. – С.34.
6. Золотарева Н. В. Создание научно-методических основ исследования влияния фармакологических препаратов на каталитическую активность алкогольдегидрогеназы печени лошади // Материалы конференции. Всероссийская научная школа для молодежи «Приборное и научно-методическое обеспечение исследований и разработок в области каталитического превращения бифункциональных каталитических превращений». – Тверь: ТГСХА, 2010. – С. 5–7.
Рецензируемые научные журналы, включенные в перечень ВАК:
7. Лапина Г. П., Золотарева Н. В. Пирацетам – регулятор каталитической активности алкогольдегидрогеназы печени лошади // Вестник ТвГУ. Сер. Биология и экология. – 2009. – Вып.11, №2. – С.56–62.
8. Лапина Г. П., Золотарева Н. В. Оптимизация течения ферментативной реакции с участием алкогольдегидрогеназы печени лошади при варьировании концентрации никотинамидадениндинуклеотида // Вестник ТвГУ. Сер. Биология и экология. – 2009. Вып.13, №14. – С.85–90.
9. Лапина Г. П., Золотарева Н. В. Анализ данных ферментативной кинетики с использованием трехмерной Kм'V' – системы координат // Вестник ТвГУ. Сер. Биология и экология. – 2010. – Вып.17, №.16. – С.71–76.
